Le traité du 1er juillet 1569 scella l'union du royaume de Pologne et du grand-duché de Lituanie, qui formèrent la «République des deux nations» sous un roi commun élu par les États des deux pays. Cette union allait durer jusqu'à la fin du XVIIIe siècle, alors que les trois puissances voisines ─ la Russie, la Prusse et l'Autriche ─ se partageront cet ensemble politique. Tous les territoires de l'actuelle Ukraine, dont Kiev, se trouvèrent sous tutelle polonaise, lituanienne ou ottomane. C'est à cette époque que les imprimeurs de Cracovie établirent, sur la base de l'alphabet latin, les normes de l'orthographe polonaise, lesquelles à quelques exceptions près, demeurent en vigueur encore aujourd'hui.  En même temps, la Pologne pratiqua une politique de polonisation des populations ruthène et lituanienne.

À partir de 1654, la Pologne, toujours sous le régime de la République des deux nations, entra en guerre contre la Russie à propos des territoires situés aujourd'hui en Biélorussie et en Ukraine; elle ne réussit pas à soumettre les Cosaques zaporogues alliés de la Russie. C'est alors que commença une longue guerre russo-polonaise qui n'allait prendre fin qu'avec le traité d'Androussovo de 1667. L'Ukraine occidentale (à l'ouest du Dniepr) fut pro-polonaise, mais l'Ukraine orientale se prononça ouvertement pour son rattachement à la Russie.